كيفية استخدام الموجات فوق الصوتية لتعطيل الخلايا واستخلاص الحمض النووي/الرنا؟

كيفية استخدام الموجات فوق الصوتية لتعطيل الخلايا واستخراج الحمض النووي / الحمض النووي؟

الموجات فوق الصوتية هي تقنية فعالة ومستخدمة عادة في تعطيل الخلايا واستخراج الأحماض النووية (DNA / RNA).مبدأها الأساسي هو استخدام تأثير التجويف والاهتزاز الميكانيكي لتدمير بنية الخلية وإطلاق المواد الداخليةفيما يلي توضيح عن الآلية المحددة وعملية الطلب والاحتياطات الرئيسية:

I. مبدأ وعملية الموجات فوق الصوتية لتعطيل الخلايا
جوهر تعطيل الخلية هو تدمير غشاء الخلية (الخلايا الحيوانية) أو جدار الخلية + غشاء الخلية (النباتات والبكتيريا والفطريات ، وما إلى ذلك) لإطلاق المواد داخل الخلية (مثل الأحماض النووية ،البروتيناتالاصوات فوق الصوتية تحقق هذه العملية من خلال الآليات التالية:
1المبدأ الأساسي: تأثير التجويف
الموجات فوق الصوتية هي موجة ميكانيكية عالية التردد ذات تردد أعلى من 20 كيلو هرتز. عندما يتم إدخال المسبار بالموجات فوق الصوتية (المضخم من المقاطع بالموجات فوق الصوتية) في عينة سائلة تحتوي على خلايا،يتم إنتاج اهتزازات عالية التردد (عادة 15-50kHz)، الذي يؤدي إلى التجويف في الوسط السائل:

الاهتزاز عالي التردد يسبب تشكيل عدد كبير من الفقاقيع الصغيرة (فقاقيع التجويف) في السائل.وأخيراً انفجر بقوة (انهيار).
عندما تنفجر الفقاقيع، يتم إطلاق طاقة فورية ضخمة (درجة حرارة محلية عالية وضغط مرتفع وموجات صدمة قوية)والقوة الاصطدامية المولدة سوف تمزق مباشرة هيكل غشاء الخلية (غشاء الخليةجدار الخلية) لتحقيق تجزئة الخلايا.
2التأثير المساعد: الاهتزاز الميكانيكي وقوة القطع
الاهتزازات الميكانيكية عالية التردد للموجات فوق الصوتية ستولد أيضاً مباشرة قوة القطع وقوة الاحتكاك على الخلايا مما يساعد على تدمير بنية الخليةخاصة بالنسبة للخلايا ذات جدران الخلايا السميكة (مثل الفطريات والخلايا النباتية).
3عملية التجزئة (استخدام العملية التجريبية كمثال)
 ضع تعليق الخلايا الذي سيتم معالجته (مثل سائل زراعة البكتيريا، ومتجانس الأنسجة، إلخ) في أنبوب الطرد المركزي أو كأس، وإدراج المسبار بالموجات فوق الصوتية (القرن) ،والمسبار بحاجة إلى أن تكون غارقة في السائل ولكن ليس في اتصال مع جدار الحاوية.

أشغل جهاز الموجات فوق الصوتية وقم بتعيين المعلمات (القوة والوقت، الخ): الاهتزاز عالي التردد يولد فقاعات التجويف في السائل،و قوة الاصطدام الناتجة عن انفجار الفقاقيع تدمر مباشرة بنية الخلية وتطلق مواد داخل الخلية (بما في ذلك الأحماض النووكلية، البروتينات، المنتجات الأيضية، الخ).
2التطبيق المحدد للموجات فوق الصوتية في استخراج الحمض النووي / الحمض النووي
تتضمن الخطوات الأساسية لاستخراج الحمض النووي / الحمض النووي: تعطيل الخلية لإطلاق الأحماض النووية → إزالة الشوائب (البروتينات والدهون والسكرات الكثيرة ، إلخ) → تنقية الأحماض النووية.يتركز دور الموجات فوق الصوتية بشكل رئيسي في الخطوة الأولى - تعطيل الخلايا الفعال وإطلاق الأحماض النوويةسيناريوهات التطبيق المحددة والمزايا هي كما يلي:
1أنواع عينات مناسبة
الموجات فوق الصوتية مناسبة لاستخراج الأحماض النووية لمجموعة متنوعة من العينات، بما في ذلك:

الأنسجة الحيوانية (مثل الكبد والعضلات): تحتاج إلى تقطيعها لأجزاء صغيرة أولاً، حيث أن الموجات فوق الصوتية يمكن أن تعطل الخلايا بسرعة وتطلق الأحماض النووية.
البكتيريا / الفطريات: جدران الخلايا صلبة نسبياً، والطرق التقليدية (مثل علاج الليزوزيم) غير فعالة، ويمكن للموجات فوق الصوتية تدمير جدران الخلايا من خلال تأثير التجويف القوي.
الخلايا المزروعة (الخلايا المتعلقة أو المعلقة): تعليق مباشر ثم الموجات فوق الصوتية، لا يتطلب معالجة سابقة معقدة.
أنسجة النبات: تحتوي على السليلوز والبكتين، يمكن أن يساعد الموجات فوق الصوتية في كسر جدران الخلايا وإطلاق محتويات الخلايا.
2المعايير الرئيسية في التشغيل (التي تؤثر على نوعية الأحماض النووية)
تتطلب المعالجة بالموجات فوق الصوتية مراقبة صارمة للمعلمات لتجنب تدهور الأحماض النووية أو التجزئة المفرطة (التي تؤثر على التجارب اللاحقة ، مثل PCR ، التسلسل ، إلخ):

الطاقة: عادةً 50 - 300 واط (معدلة وفقًا لنوع العينة ، مثل البكتيريا التي تتطلب طاقة أعلى).والقوة المنخفضة جداً سوف تؤدي إلى تجزئة غير كافية.
وقت العمل/فترة الفاصل: Use "pulse" treatment (such as working 30 seconds + intermission 30 seconds) to avoid continuous ultrasonic heat generation leading to nucleic acid denaturation (DNA/RNA is easily degraded at high temperature).
وقت العلاج الإجمالي: يعتمد على العينة (مثل 1-3 دقائق للخلايا الحيوانية و 3-5 دقائق للبكتيريا).
تحكم في درجة الحرارة: حمام الثلج طوال العملية (يتم وضع العينات على الثلج) ، لأن العملية بالموجات فوق الصوتية ستولد الحرارة (تأثير التجويف يرافقه درجة حرارة عالية محلية) ،درجة الحرارة المنخفضة يمكن أن تمنع نشاط النوكلياز وتحمي استقرار حمض النوكلييك.

3المزايا والاحتياطات
المزايا
كفاءة عالية: أسرع من الأساليب التقليدية (مثل الطحن، والتجمد المتكرر والذوبان، والتحليل المائي الإنزيمي) (يتم في العادة في غضون دقائق قليلة) ، وتعطيل أكثر دقة.
العولمة: قابلة للتطبيق على مجموعة متنوعة من أنواع العينات (الحيوانات والنباتات والكائنات الدقيقة، إلخ) ؛
سهولة التشغيل: لا تحتاج إلى مادة تجريبية معقدة، فقط أجهزة الموجات فوق الصوتية ومعدات الطرد المركزي الأساسية.
الاحتياط
تجنب الفقاقيع: إذا كان هناك عدد كبير من الفقاقيع في العينة، فإن كفاءة تأثير التجويف ستقل، وقد يتجمد المسبار.تأكد من أن المسبار غارق تماما في السائل (مستوى السائل حوالي 1-2 سم);
تثبيط النيوكلياز: بعد التعطيل، يجب إضافة محلول الليزيز (بما في ذلك EDTA، المنظف، إلخ) في الوقت المناسب لتثبيط النيوكليازات داخل الخلية (مثل RNase التي تتحلل بسهولة RNA) ؛
حجم العينة: يجب ألا يكون حجم المعالجة الفردي كبيرًا جدًا (عادة ≤5 مل) ، وإلا فإن توزيع الطاقة بالموجات فوق الصوتية سيكون غير متساوٍ ويتباين تأثير التعطيل بشكل كبير.

ملخص
الصوت فوق الصوتي يعطل الخلايا بكفاءة من خلال تأثير التجويف والاهتزاز الميكانيكي ، مما يوفر "خطوة إطلاق" رئيسية لاستخراج الحمض النووي / الحمض النووي.الوقت ودرجة الحرارة لتعطيل الخلايا بالكامل مع زيادة حماية سلامة الأحماض النوويةتستخدم هذه التكنولوجيا على نطاق واسع في مرحلة ما قبل المعالجة من تجارب البيولوجيا الجزيئية (مثل استنساخ الجينات ، qPCR ، تحليل النسخ ، إلخ).) وهي أداة مهمة لاستخراج الأحماض النووكية.